反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。本文为您阐述反相色谱柱的清洁与再生技术。

反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。

    固定相上还有少数物质，如混合相（例如苯基－己基）、末端封闭和非末端封闭种类和极性嵌入相－也存在于这些键合硅胶上。还有很多填料用于反相色谱，包括聚合物，聚合物表面涂上硅胶和氧化铝，无机－有机混合物，涂层氧化锆，和石墨化碳。不同种类的固定相有他们自己的优点和缺点。

    反相色谱柱利用各种流动相和添加物可以有很多的应用。一些技术利用添加物可以改变或修饰填料的表面。有时候这些添加物有可能会污染键合相表面。

    硅胶表面因为有着疏水键合相而有一些别的化学性质。残留的硅烷醇存在于所有的硅胶键合填料中。这些硅烷醇具有弱酸性，因此能与某些待分析物合基质成分，特别是碱性成分。因为硅烷醇的pKa值大约是4.5，离子化能在中性pH条件下发生因此与阳离子产生静电相互作用就有可能发生。较老的A型硅胶能容纳高浓度金属离子（有时候100ppm或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大甚至能发生金属鳌合现象或清除一些化合物。残留硅烷醇在非末端封闭的硅胶合短链键合相如C2或C4上更让人烦恼。

    使用者必须清楚他们所用的固定相表面特殊性质和可能的分析物－固定相表面的相互作用，这样当他们使用反相方法时才能考虑到可能的基质相互作用。例如，非常疏水的样品基质如玉米油，高芳香物质，和蜡能粘住固定相装填表面并且改变他们的性质。含有蛋白质物质的生物流体也能吸附在装填表面。尽管分析者想尽最大努力来保护HPLC柱子，某些分析物－基质污染能使固定相受到有害的影响。

   本文为您阐述反相色谱柱的清洁与再生技术。

    当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的柱子能产生反压问题。被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。这部分的"柱子观察"将讨论可行的方法使柱子回复原来的或差不多原来的状态。因为键合硅胶柱子是最受欢迎的，我重点讲述这种柱子。最后，我将讨论别的反相柱子的清洁步骤。

    什么导致反相柱子污染产生？通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。

    有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积。

    清洗硅胶键合柱子

    再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90～100％的溶剂B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。（表2列举了不同规格的HPLC柱子的空体积，因此读者能方便地确定相应柱子冲洗的体积。）例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。冲洗5～10个体积以后才更换强溶剂。

    有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子乐，如果污染物是非生物物质，使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。

    一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。

    对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列：

    100％甲醇
    100％乙晴
    75％乙晴－25％异丙醇
    100％异丙醇
    100％二氯甲烷
    100％正己烷

    用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗10个柱体积。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速来冲洗，要回复原来的溶剂体系，不需要每一步都冲洗，可以跳过中间步骤。中间步骤推荐使用异丙醇，然后用没有缓冲的流动相，最后回复起始流动相配置。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果使用者怀疑柱子被严重污染，可以二甲基亚砜（DMSO）或者二甲基甲酰铵和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流过色谱柱。成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作还有一个问题是清洗过程中是否可以把HPLC柱子反过来。因为大多数强保留的污染物都会累积在柱头，把柱子反过来可以缩短污染物被冲出柱子的移动距离。考虑到装填柱子的稳定性，现在大多数HPLC柱子都是比普通操作压力大很多的高压装填的，因此他们的柱床应该不会受到反方向流速的影响。但是，如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。例如尾部烧结的孔径是2μm，他通常能够留住平均5μm孔径里的填料。有时侯厂家会让头部孔径较大以避免样品或流动相颗粒堵塞。如果这种孔径大于装填颗粒尺寸分布曲线的最小粒径时，有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱，这样会导致空白出现。如果柱子有箭头标志建议的流动方向，我建议通过操作手册和说明书，厂家主页或者技术支持部门等确认是否可以把柱子反过来冲。无论你是否把柱子反方向，最好不要让溶剂通过检测器避免污染物和穿透缝隙的颗粒进入检测池，否则有可能引起污染。

    清洗柱子频率主要看有多少强保留物质被打入色谱柱。因为反相柱有时候在分辨率消失或者鬼峰出现前能承受很大的污染，使用者经常会等到出现了异常情况才开始注意。然而，污染物过多的累积会导致清洗柱子的难度加大。所以，如果你知道经常用杂质较多的样品上样时，我建议你们有规律地清洗柱子，你越是频繁清洗柱子，就清洗起来就越不费劲。

    清洗硅胶键合反相柱的蛋白质残余

    如果是生物物质如血浆或血清等积累在反相色谱柱上，操作者必须采用不同的清洗程序。大部分情况下，纯有机溶剂如乙晴或甲醇不溶解多肽和蛋白质因此不能有效地清洗柱子。然而，有机溶剂和缓冲液、酸、离子对试剂等的混合物则能有效地溶解。一开始，先开始尝试用百分比含量高的高强度溶剂（溶剂B）冲洗一体积。Freiser和他的合作者发现重复变化三氟乙酸水溶液和三氟乙酸－丙醇之间梯度的高低可以再生被污染的反相柱子。Bhadwaj和Day认为在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇就能起到效果。如果上述几个方法都不成功，Cunico和他的同事推荐了几种强溶剂和增溶剂来除去蛋白质（见表三）。在使用这些溶剂之前，可以先咨询柱子的厂商确保这些溶剂能与柱子的填料相容。硅胶基质的柱子通常来说都是相容的，但有机聚合物基质的柱子可能会在某些溶剂组合中膨胀或收缩，这样会影响其色谱行为。

    当用前述的溶剂系列时，确保表三所提到的溶剂能与系列中的溶剂互混。对每个溶剂系统至少要冲洗20体积。由于有些溶剂系统黏性很大，冲洗的流速应该相应调整以确保不会超过泵压。用完胍或尿等溶剂侯，至少应该用40～50体积的HPLC级水来冲洗柱子。

    对于反相柱子，不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和三硝基甲苯，因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上很难除去。用表面活性剂会影响装填表面而改变其性质。然而有一个分离小组的研究表明由某个小组做的污染后的柱子可以用500μL1％SDS溶液用1ml/min的流速清除下多肽合成产物。如果继续用从5％～95％含1％（v/v）三氟乙酸的乙晴梯度洗脱，可以恢复多肽的分离。

    清洗反相柱的特殊技巧

    有时候，用有机溶剂清洗污染柱子并不能成功。如果金属离子吸附在硅胶或键合相上这种情况更有可能发生。用鳌合剂如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）通过色谱柱时，含有很多金属离子的EDTA复合物能溶解他们。用完EDTA溶液后，分析者一定要用水完全冲洗柱子。如果样品含有离子化合物，变化pH可以使他们转为非离子状态，这样他们就可以被水－有机溶剂混合物洗脱下来。例如，强碱性物质能在pH低于3时被除去，在这个条件下质子铵变得水溶性更好。酸性物质能在pH调整到大于其pKa时被洗下来--大约时pH8或9，这个状态酸性物质处于离子状态。然而，要注意硅胶柱子在长时间处于高pH条件下容易被破坏。

    要避免缓冲液或用缓冲液保存的柱子长菌，可以用普通家用漂白剂1：10或1：20来冲洗。在这之间至少要打50体积色谱纯的水。不能让漂白水通过检测器，因为漂白水会腐蚀检测池。避免溶剂瓶中缓冲液长菌，每次只取足够的缓冲液用，把没用的保存在冰箱里，添加0.1％叠氮化钠在缓冲液中，用缓冲液保存的柱子不能长期不用。

    色谱工作者经常会讨论到离子对色谱中离子对试剂对固定相的影响。显然离子对试剂如辛烷－磺酸（用于阳离子）和四烷基铵溴（用于阴离子）在一定浓度的有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键合柱子上。柱子因此被污染很难回复到起始状态，因此人们都认为任何用于离子对的柱子都会被破坏而且用于不能再用于普通的反相色谱。

    Bidlingmeyer不同意这种观点，他认为用于离子对色谱苛刻的pH值会通过水解键合相和在酸性条件下（pH1-3）硬化硅胶或在高pH条件下（pH7-8）溶解硅胶使一些柱子的性质改变。要清除离子对试剂中的磺酸，他建议首先用相同的没有离子对的缓冲液（至少20体积）冲洗然后用没有缓冲液的流动相(在清洗过程中甲醇可能比乙晴更有效；如果是长链的离子对试剂，用四氢呋喃)。很明显，磺酸离子对试剂和铵离子对试剂有着不同的表现。Bidlingmeyer和他的合作者证明了在C18柱子上用流动相浓度大于70％的甲醇，长链离子对试剂，SDS不会吸附在固定相上。这个发现跟分离组的结果一致。硅胶键合整体柱如Chromolith 柱子（默克公司，德国）可认为跟别的硅胶柱一样。

    聚合柱子的再生

    用来分离生物分子的聚合柱也会被污染也需要清洁。聚合材料的化学稳定性通常以作用力来衡量。事实上，很多厂家建议用1.0M的硝酸或1.0M的氢氧化钠来清洗。一些反相聚合柱如用聚（苯乙烯－二乙烯基苯）（PS－DVB）小球和聚合单体如CIM RP－SDVB片（BIA分离，Ljublijana，前苏联）和Swift柱子（Isco，Lincoln，Nebraska，美国）能耐宽的pH范围（通常pH11～13或有时pH0～14），但使用者用强有机溶剂冲洗柱子时要注意。由其交联度决定，当柱子用某些有机溶剂冲洗时就会膨胀或收缩。高于8～10％交联度的聚合物通常有较好的机械性能在水溶液中收缩很少在有机溶剂中膨胀也不大。用一系列溶剂洗聚合柱子之前最好能咨询生产者或技术支撑部门。

    根据BIA分离，使用者可以再生聚合PS－DVB整体柱通过下面的方法：

    含0.1％三氟乙酸的2－丙醇在一半工作流速下冲洗10个柱体积以上
    100％流动相B在工作流速一半的条件下冲洗5个柱体积以上
    用100％流动相A在工作流速下至少平衡10个体积以上

    如果要含有丁基和乙基化学物质甲基丙烯酸酯基质的整体柱要清洗，沉淀的蛋白质可以通过按顺序反向冲洗10个柱体积的1.0M氢氧化钠、水、20％乙醇溶液和工作缓冲液来清除。如果有很多疏水蛋白质，使用者应该在水以后插入一个30％异丙醇或70％乙醇的步骤。

    如果要清洗或灭活微生物菌落，PS－DVB可以用0.5～1.0M的氢氧化钠完全清洗。整体柱在室温下至少要用氢氧化钠洗一个小时。

    用传统聚合基质装填的柱子来分离一些溶解度很小的蛋白质如膜蛋白、结构蛋白、和病毒外壳蛋白等需要用较强的清洗条件。例如含3M盐酸胍的50％异丙醇溶液在60℃才能把这些蛋白质除去。

    在固相树脂中去除合成肽能产生重新激活被苯甲醚和苯硫基甲烷清除的正离子。清除正离子反应产生了大的芳香族分子，这些芳香族分子会在肽纯化时污染柱子。这种污染物在C18柱子上有非常高的保留没法被100％的甲醇或乙晴洗出。要清洗这类柱子，必须把柱子反向用5体积100％异丙醇，三到五个体积二氯甲烷，然后三到五体积异丙醇，最后到初始溶剂系统。芳香族不纯物的洗脱可以通过260nm紫外检测。

    氧化锆基质HPLC柱子的再生

    ZirChrom Separations，Inc.（Anoka，Minnesota，USA）生产了一系列的氧化锆基质柱子。该产品系列有几种反相柱子，包括聚丁乙烯，聚苯乙烯和游离碳版本。氧化锆比硅胶柱子的pH耐受性要好，所以涂上氧化锆能够耐受更苛刻的条件如高pH和操作温度。然而，因为其特殊表面性质，分析者应该保持一定的实验条件用于成功分析各种分析物。羧酸，氟化物和磷酸根离子都在氧化锆柱子上有强吸附。要清楚这些物质，应该用20％乙晴－0.1M氢氧化钠或0.1M四甲基氢氧化铵混合物冲洗50个柱体积，10体积水，50体积20％乙晴－0.1M硝酸混合物，10体积水，最后是20体积100％有机溶剂。对于聚丁乙烯和聚苯乙烯柱子，色谱操作者可以用甲醇、乙晴、异丙醇、或四氢呋喃。而游离碳柱子至少要用20％四氢呋喃。

    反相柱子会因为重复注入含有强保留物质特别是分子量大的或疏水的样品而被污染，生物流体成分如蛋白质和强碱性物质可以吸附在硅胶介质上。另外，某些流动相添加剂如离子对试剂和表面活性剂能吸附在装填表面而改变他们的性质。被污染的柱子会导致峰形差，保留行为重复性差，高反压，和基线漂移等现象。通常，用有机溶剂或者是能够破坏污染物与键合相或硅胶表面的试剂能够清洁这些柱子。

    色谱工作者在使用这种有腐蚀性或对键合相有破坏作用的试剂时要注意。此外，利用样品准备工作可以尽量减少柱子与不受欢迎物质的接触从而减少污染。对所有操作我觉得应该使用保护柱来避免对分析柱污染。

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