高效液相色谱柱由柱管与填充的固定相填料组成，常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。柱接头将过滤片与色谱柱管连接。

概述

高效液相色谱法是19世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法基础上发展起来的新型分离分析技术，在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面取得了巨大的进步，已在生物工程、制药工业、食品工业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。

高效液相色谱柱是液相色谱系统获得分离的核心部件，许多分离问题都归结于色谱柱。不同类型的色谱柱代表了不同的色谱方法。

高效液相色谱柱与经典液相色谱柱相比，采用全多孔微粒固定相，装填在小口径的不锈钢柱内（长度大幅缩短），在高压环境下，溶质的扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。

高效液相色谱柱结构及评价

高效液相色谱柱由柱管与填充的固定相填料组成，常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。柱接头将过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料，此烧结片上孔径小于填料颗粒直径，却可让流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小的机械杂质以保护色谱柱。再用连接注螺帽、柱密封圈等将主接头固定住。

在实际工作中，选择性能良好的色谱柱可得到好的结果，首先要注意柱径、长度、填料种类和填料粒度。评价一根色谱柱的主要指标是：

（1）塔板数N值

直接关系到如何更好地分离样品，仅适用于不拖尾的对称峰。

（2）峰不对称性

可用不对称因子AS测量，AS趋向于1是最好的。

（3）柱压降

在满足分离要求时，柱压越低越合适。

（4）键合相浓度

如果浓度低表示未完全键合，则造成保留不能重复。

高效液相色谱柱分类

不同种类液相色谱柱的差异在于柱结构、柱填料和柱尺寸的不同。

按色谱柱的尺寸（长度和内径）可分为制备型、常规分析型和微型。

按柱填料类型可分为：

（1）反相色谱柱，通常是在硅胶颗粒表面利用羟基活性键合烷基链（-C1、-C4、-C8、-C18等）或苯基（-Ph）等生成非极性键合固定相，以C18（ODS）使用最为广泛。由于硅胶基质的在碱性条件下可能造成柱床塌陷，市场上已有有机硅胶/无机硅胶混合基质的反相色谱柱（如YMC-Triart系列反相柱）与有机聚合物基质的反相色谱柱（如YMC Polymer C18）。

（2）正相色谱柱，通常使用球形硅胶颗粒作为填料，或为改善分离性能而硅胶颗粒表面键合腈基（-CN）、胺基（-NH2）、醚基（-O-）生成极性键合固定相。

（3）离子交换色谱柱，在硅胶或聚合物表面引入阳离子交换基团或阴离子交换基团。

（4）体积排阻色谱柱，以凝胶为填料，要依据分子尺寸大小的差异来进行分离。

（5）手性色谱柱，用于分离手性异构体。

（6）亲和色谱柱，固定相由基体、间隔臂和配位体三部分构成。

高效液相色谱柱日常维护与保养

色谱柱的使用寿命，除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关外，最主要的是与日常的维护密切相关。

色谱柱的使用寿命主要是根据柱效和柱压两个指标来衡量，如果一根色谱柱的柱效太低或柱压太高，通常被认为该色谱柱的使用寿命已经结束。因此，延长色谱柱使用寿命的关键是，消除引起柱效下降和柱压升高的因素。以下是色谱柱的日常维护方法;

1、流动相的pH应在色谱柱所规定使用范围内

流动相超过色谱柱所能承受的pH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂，使柱效下降，使用寿命变短。由于流动相的pH控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难使色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的PH值

2、使用保护住和流路过滤器

样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰形拖尾、变宽，从而使柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，防止堵塞色谱柱筛板。由于柱压升高在分析故障中占很大比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议在色谱柱进样端上加上保护住和在线过滤器。

如果确认色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的，针对反相色谱柱可选择以下方式使柱压恢复正常：

1）先在色谱柱前加上保护住或在线过滤器，然后用甲醇/水=20/80 1.0ml/min反向冲洗色谱柱180min。

2）先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器，然后反向使用。

3、正确使用缓冲盐溶液

通常缓冲盐易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会使其析出，堵塞填料基质的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上键合的碳链难以舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。

缓冲盐的正确使用方法：

1）等度条件：使用缓冲盐之前和之后都用过渡流动相以1.0ml/min流速各冲洗60min。

2）梯度条件：使用缓冲盐前用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0ml/min流速各冲洗60min,梯度设定尽量平缓，以避免梯度过程中缓冲盐析出；

注意：过渡流动相是指有机相和水相的比例与分析流动相相同，只是过渡流动相中不含缓冲盐。

3） 缓冲盐溶液不能存留于色谱柱中过夜。

4）缓冲盐析出的补救方法：

方案1：用甲醇/水=20/80以1.0ml/min流速35℃条件下反向冲洗色谱柱120min；

方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。

4、防止强保留物质存留在色谱柱中

强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰形变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。

由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多样品特别是复杂样品我们不知道是否含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每一天的日常维护中，用纯甲醇或乙腈清洗。

清洗方法：

1）未使用缓冲盐：每天分析完后，用纯甲醇或纯乙腈反冲洗色谱柱60min。

2）使用过缓冲盐：分析完后，先用上述方法除去缓冲盐，然后再用纯甲醇或乙腈反向冲洗色谱柱60min。

3）补救方法：用纯甲醇或乙腈反向冲洗180min。

常见故障及解决方法

选择了一根好的柱子，再加上有效的维护与预防，可以避免不少意外故障的发生。但谁也不能保证色谱柱“永远”不出故障，任何一根色谱柱最终都会柱效柱直至报废。损坏的标志：

①塔板数下降；

②峰形变坏；

③压力增加；

④保留时间变化。

有时往往是几种情况伴随着同时发生。

1、塔板数下降

在色谱柱使用过程中，塔板数会不断下降。一般情况下，进2000个样品后柱效N值要降低50%（但也不能一概而论）。如果柱效下降很快或突然下降，应考虑柱头塌陷或进了不合格的样品。

2、峰形变坏

出现峰拖尾、分叉峰或非高斯峰的原因很多，但总是与塔板数骤然下降联系在一起的，峰形变坏而保留时间不变，多半是柱受到阻塞（不锈钢烧结片），或者柱头有了空穴。

3、压力增加

和柱塔板数不断减少一样，在使用过程中柱压慢慢增加，可视为正常。如果压力很快增加过高，应考虑两种可能，二是样品沉积在柱内，而是柱内硬件阻塞。

对于第一种情况，要用溶解所用样品的溶剂冲洗，冲洗时拆开柱与检测器之间接头，以防污染检测器流通池。如冲洗无效，应考虑是第二种情况，先更换烧结不锈钢过滤片。换滤片时尽量不要搅动柱头填料，如有塌陷，可用同种填料加乙醇调成糊状补平柱头，压紧，压平，柱性能可能恢复如前。如果柱头填料已脏，可挖去2-3mm，用新填料填平。

4、保留时间的改变

保留时间的变化有两种类型的情况，一是同一根色谱柱样品间的保留变化，二是不同柱之间的保留变化。对于第一种情况，在排除流动相比例和pH值的差异以及流速差异所引起的保留变化外，再确认色谱柱中是否有强保留的物质残留，如有残留，请用强溶剂冲洗。第二种情况主要是由于生产厂家提供的色谱柱批次之间的差异所引起的，如果保留时间变化不大，可通过微调流动相或流速来解决，如果对于保留时间的再现性有特别要求，请在购买之前向供应商说明，以选购质量可靠的产品。

参考资料

1、色谱技术丛书，化学工业出版社

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